全自(zì)動蛋白免(miǎn)疫(yì)印(yìn)跡(jì)處(chǔ)理係統在(zài)實驗(yàn)中可能出現的(dí)常(cháng)見問題(tí)主要(yào)包(bāo)括信號弱或無(wú)信(xìn)號，背(bèi)景(jǐng)高，多帶(dài)現象，條帶(dài)異(yì)常(cháng)等，以(yǐ)下(xià)是對這(zhè)些問題的詳細分析：
信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)
一抗(kàng)和(hé)二抗(kàng)不匹配(pèi)：二(èr)抗(kàng)需(xū)和一(yī)抗宿主(zhǔ)的(dí)物種(zhǒng)相同(tóng)，例如一抗(kàng)來自(zì)鼠(shǔ)，二(èr)抗(kàng)則(zé)應是(shì)抗(kàng)鼠抗體。
抗(kàng)體濃(nóng)度(dù)不(bù)足：使用高濃度(dù)抗(kàng)體，並在4℃條件(jiàn)下延長(cháng)孵(fū)育時間，如(rú)過(guò)夜孵(fū)育(yù)。
封閉劑與(yǔ)抗體交(jiāo)叉(chā)反(fǎn)應：使(shǐ)用溫和(hé)的去汙(wū)劑(jì)如(rú)吐(tǔ)溫-20，或更換封閉(bì)劑(jì)（如脫(tuō)脂奶粉，BSA，血清，明膠(jiāo)）。
一(yī)抗不識別待檢(jiǎn)物(wù)種的蛋白：參照說明書，對(duì)比免疫(yì)原(yuán)序列(liè)和蛋(dàn)白(bái)序列，確(què)保抗體(tǐ)和目(mù)的(dí)蛋白(bái)會發(fā)生反應，並設置陽性(xìng)對(duì)照(zhào)。
蛋白上(shàng)樣量(liáng)不足：每條(tiáo)泳(yǒng)道(dào)蛋白(bái)上樣(yàng)量一般不超過(guò)20μg，使用蛋白(bái)酶抑製劑並設(shè)置陽性對(duì)照(zhào)。
轉(zhuǎn)膜不充(chōng)分：使(shǐ)用(yòng)可逆染色劑(jì)檢(jiǎn)測(cè)轉膜(mó)效果(guǒ)，檢(jiǎn)查轉(zhuǎn)膜操作是(shì)否(fǒu)正確，如PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇(chún)中(zhōng)，然後(hòu)浸到轉(zhuǎn)移緩衝液(yè)中。
一抗(kàng)失(shī)效：使(shǐ)用(yòng)新鮮(xiān)抗體，避(bì)免(miǎn)重(zhòng)復使(shǐ)用(yòng)導致有(yǒu)效(xiào)濃度(dù)降(jiàng)低。
二抗受疊氮鈉抑(yì)製：避免(miǎn)疊氮鈉和HRP標記抗(kàng)體(tǐ)一起(qǐ)使用。
檢測試劑盒(hé)過期或底(dǐ)物失活(huó)：使(shǐ)用(yòng)新(xīn)鮮的(dí)底物。
背(bèi)景高
未進(jìn)行特(tè)異性封閉或封閉(bì)不充分：延(yán)長封(fēng)閉(bì)時(shí)間，考慮(lǜ)更(gēng)換(huàn)合(hé)適(shì)的(dí)封閉(bì)劑。
一(yī)抗或(huò)二(èr)抗(kàng)濃(nóng)度(dù)過高：稀釋抗體至(zhì)合(hé)適濃(nóng)度(dù)，或(huò)以更高稀(xī)釋(shì)度抗體延長孵育時(shí)間。
二抗與(yǔ)封閉劑非特異性結(jié)合(hé)或(huò)反(fǎn)應：設(shè)置(zhì)二抗(kàng)對照(zhào)（不加一(yī)抗）。
未結合蛋白(bái)質洗滌不(bù)充分：增加洗滌次數。
膜幹(gān)燥：在孵育過程(chéng)中(zhōng)防止膜變幹，每(měi)一步(bù)都(dū)要保證膜(mó)有充分的(dí)反應液，可(kě)放(fàng)入(rù)攪(jiǎo)拌子不斷攪動(dòng)或輕輕(qīng)震蕩(dàng)使膜(mó)浸在溶(róng)液中(zhōng)。
選膜不(bù)當(dāng)：硝酸纖(xiān)維(wéi)素膜（NC膜(mó)）比(bǐ)PVDF膜背(bèi)景低(dī)，可根據實驗(yàn)需(xū)求(qiú)選擇(zé)合適的膜(mó)。
多(duō)帶現象
細(xì)胞(bāo)傳代次數(shù)過多(duō)，蛋白表達不(bù)同：使用原始(shǐ)未傳代的細胞株(zhū)，和現在(zài)的(dí)細胞株一起做平(píng)行對照(zhào)實驗。
體(tǐ)內表(biǎo)達的蛋白樣(yàng)本具有多(duō)種(zhǒng)修(xiū)飾形式：如乙酰(xiān)化，甲基(jī)化(huà)，烷基化，磷(lín)酸化(huà)，糖基化等，可(kě)使(shǐ)用(yòng)試劑使樣(yàng)品去磷(lín)酸(suān)化，去糖基化(huà)來(lái)證明(míng)翻譯後的(dí)修飾(shì)。
蛋白(bái)樣本(běn)降(jiàng)解：在樣品(pǐn)緩衝(chōng)液(yè)中加入足夠的蛋(dàn)白(bái)酶(méi)抑(yì)製(zhì)劑。
檢測到未經(jīng)報(bào)道過的新蛋(dàn)白(bái)或同(tóng)一蛋(dàn)白(bái)家(jiā)族(zú)中具有相(xiāng)似(sì)表位而結(jié)構(gòu)不(bù)同的(dí)蛋白：查(chá)閱(yuè)其他文獻報(bào)道，或使用BLAST搜尋，使(shǐ)用說明書(shū)推薦(jiàn)的(dí)細(xì)胞株或(huò)組(zǔ)織。
一抗(kàng)濃度(dù)過(guò)高：降低抗體(tǐ)濃(nóng)度(dù)和/或孵育時間。
條(tiáo)帶異常
背(bèi)景(jǐng)有不(bù)均匀(yún)的白色斑(bān)點：轉膜時膜(mó)上(shàng)有氣泡(pào)或抗(kàng)體在膜(mó)上(shàng)分(fēn)布不(bù)均(jūn)，轉(zhuǎn)膜(mó)過程中(zhōng)應(yīng)盡(jìn)量去除氣(qì)泡，抗體(tǐ)孵育(yù)時保持搖動。
背景有黑(hēi)色斑點：抗體(tǐ)結(jié)合(hé)了封閉劑，可(kě)過(guò)濾(lǜ)封閉(bì)劑。
深(shēn)背(bèi)景出現白色(sè)條帶(dài)：一(yī)抗或二(èr)抗加入(rù)過多(duō)，應(yīng)稀釋抗(kàng)體的濃度。
目的條帶(dài)染(rǎn)色過低(dī)/過高，分離不(bù)徹(chè)底：改變(biàn)凝(níng)膠(jiāo)比例，分子量大(dà)的蛋白用(yòng)低濃(nóng)度膠，分(fēn)子(zǐ)量小(xiǎo)的蛋(dàn)白(bái)用(yòng)高濃(nóng)度膠。
條帶“微笑(xiào)”效應：遷移過快或電泳溫度過高改變了pH值和遷移速(sù)度(dù)，可(kě)降低(dī)遷移速(sù)度或(huò)低溫電泳（如在(zài)冷庫(kù)或(huò)冰(bīng)上進行）。
相(xiāng)同蛋(dàn)白雜交(jiāo)出現不(bù)均(jūn)匀條帶：製備凝膠時凝(níng)膠凝固(gù)太(tài)快，致(zhì)使(shǐ)泳(yǒng)道中丙(bǐng)烯(xī)酰胺(àn)的(dí)比(bǐ)例不均(jūn)匀，可(kě)參(cān)照(zhào)凝膠(jiāo)的(dí)配方(fāng)，在凝(níng)膠(jiāo)中加入適(shì)量(liáng)TEMED，放置(zhì)時在凝膠(jiāo)頂部加(jiā)入適(shì)量1%SDS（水稀釋(shì)）以(yǐ)防(fáng)凝(níng)膠變幹。
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